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支原体污染的影响是什么?如何应对呢?

提供者:上海威正翔禹生物科技有限公司   发布时间:2021/1/6  阅读次数:258次   进入该公司店铺我要询价

细胞培养过程中,由于实验环境、操作者鼻腔口腔、实验器材等很多地方都有支原体的存在。因此,细胞发生支原体污染的频率很高。据美国数据统计,细胞发生支原体污染的几率在70%以上。

同时,由于支原体直径很小,仅在180nm~350nm之间,只有通过电镜才能看到。因此,支原体污染不易被实验者肉眼发觉。而支原体污染是个循序的过程,普通抗生素对其无效。因此,被支原体污染的细胞会持续受到影响,导致实验数据不准确。

支原体污染不仅是细胞培养中需要克服的现象,而且是制药、生物制品生产中需要加以避免的。支原体污染的影响是什么?


 

 

抑制细胞增殖达50%

●影响免疫反应

●影响病毒增殖和感染率

●引起染色体畸变和易位

●干扰杂交瘤技术使被污染细胞在HAT培养基更敏感

●在细胞壁上附着支原体会改变细胞壁完整性。

●降低电穿孔转染率达5%

总之,支原体污染影响细胞所有的代谢功能。


 

细胞被支原体污染,解决方案

方法:确认细胞已被支原体污染,终止试验,丢弃所有被污染的细胞和耗材。

重新复苏细胞,注意选用未被污染的细胞株、血清和培养基,并规范操作。

方法二:对于珍贵的,样品不可再得的细胞,或价格昂贵的种子细胞,不但无法丢弃,而且作为种子细胞,还需要彻底根除支原体污染。

此时,需选用特异性的支原体杀除剂,清除污染,保护细胞。

目上有效的方法是是德国的款利生物试剂,由Minerva公司生产,品名Mynox®。

此试剂可在2-3小时内将支原体主动杀除,但对细胞无毒害作用。特别适合细胞保种。

Mynox®为枯草杆菌中提取出的生物制剂,加入培养液中,可特异性地与支原体膜结合,改变膜通透性。通过此生物物理的方法,2~3小时内,即可把细胞中的支原体杀除掉。因为细胞膜结构与支原体膜不同,故Mynox®不会与细胞膜结合,因此无细胞毒性。

注意:3小时后,需将此试剂洗脱,将细胞更换到新的培养耗材和培养液中,重新培养。

此时,不应使用PCR方法检测细胞中支原体。由于支原体解体,故PCR结果为假性强阳性。

具体操作流程见下图:

 

Mynox®祛除贴壁细胞中支原体的流程图

Mynox®杀除支原体功能强大有效,但由于价格昂贵,上图中使用的200ul人民币要5000元左右,使得应用于细胞保种的数量受到价格的限制。

方法三:对于已耗费很多时间,大量扩增起来的细胞,或经过基因转染、体外刺激等大量工作处理过的细胞,如果发现细胞被支原体污染了,怎么办?此时由于期工作量巨大,使操作人员无法丢弃已有细胞。

但由于价格原因,又无法使用方法二提到的昂贵试剂杀除细胞上的支原体,

同时,实验人员还需要清除细胞上的支原体污染,让实验得以往下推进,以终获得准确的实验数据。

此时,实验者可选用对支原体特效的抑制剂,通过对细胞的期处理,中期加药,逐步通过4代左右的培养,得以将支原体污染彻底清除,确保试验顺利推进,结果准确。

全此类试剂众多,笔者周围的实验人做过很多尝试,其中效果确切且性价比较高的当属德国Minerva公司的ZellShield®祛除剂。

它的原理是:通过抑制支原体增殖中某种蛋白的合成,达到抑制新的支原体增殖的目的。属复合型的新型抗生素。

注:使用ZellShield®时,不需使用链青霉素。

 

操作步骤:

第步:研究发现,98%的支原体污染发生在细胞间隙。因此,先要把细胞消化下来,放入离心管,悬浮冲洗,离心,弃上清,反复三次。此时可将细胞上大部分的支原体去除,为进步加药抑制做好准备。

第二步:培养液中加入1%的ZellShield®,细胞进行正常培养。新的支原体增殖受到抑制,旧的支原体随着细胞的换液逐步减少,通过4代左右的培养,细胞中的支原体基本可被彻底清除。

此试剂价格约2800元/50ml,1%浓度使用,可保证大量细胞的实验得以顺利推进。性价比较高,但祛除过程时间稍长。

有些细胞保种中心,当珍贵细胞被支原体污染后,会将Mynox®和ZellShield®结合使用,效果确切,结果令人满意。

工作环境中支原体污染,解决方案

如果实验室的细胞经常发生支原体污染,则需考虑的污染源可能来以下几个方面:

1、细胞种子被污染,解决方法参见以上“方法二”和“方法三”;

2、细胞培养中,使用未经严格过滤祛除支原体的牛血清。

某些血清生产厂,为低价占市场同时还能获得充足利润,他们需要降低生产成本,所以会将生产中,成本高的100nm过滤三次的步骤缩减,导致血清成为支原体的污染源。

(全球标准的血清生产规范为:粗血清需经七次过滤,后三次为100nm加压过滤,可以清除支原体);

此情况需详细考察血清供货商的业程度,通过索要《检测报告》等书面文件为血清获得更多质量保证。同时,对业水平不高的血清供货商,适当延长血清试用期。

3、洁净台、细胞培养箱内部、培养箱水槽、液氮罐,培养间内部的水浴锅等环境被支原体污染,可对工作区域进行消毒。有以下三种方法:

A、甲醛高锰酸钾熏蒸消毒

  •  
  • 40%甲醛溶液用量为10ml/m3,高锰酸钾用量为5g/m3
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  • 先将称好的高锰酸钾放到开放性容器内,然后倒入甲醛溶液
  •  
  • 人员迅速撤离,密闭消毒空间
  •  
  • 熏蒸消毒要求密闭消毒24h以上

缺点:甲醛有刺激气味,细胞间1-2周无法使用。

B、酒精擦拭

  •  
  • 用75%的酒精对超净台、培养箱、桌面等进行擦拭
  •  
  • 再通风10分钟
  •  
  • 紫外照射30分钟

缺点:操作较为繁琐,酒精容易挥发,消毒维持时间不长。

C、用门清除支原体的喷雾剂或湿巾消毒

目,被各大实验室普遍使用的是Mycoplasma-offTM喷雾剂和湿纸巾。它添加了可主动杀除支原体的Mynox®试剂,可在 几分钟内将支原体确切杀除,无残留,无腐蚀性,无致癌性。

  •  
  • 均匀喷于待消毒的洁净台或实验设备表面
  •  
  • 等待5-10分钟
  •  
  • 用干燥纸巾将喷过的表面擦拭干净
  •  
  • 通风2-3分钟

对于移液器,门把手,电话等器材,可使用支原体清除湿巾。擦拭后,应让其被消毒物体的表面保持湿润,再让其自然风干。

D、培养箱水槽、培养间内部的水浴锅

水槽经常会成为支原体以及真菌霉菌滋生的污染源。

解决方法:

  •  
  • 勤于清洗显得尤为重要。
  •  
  • 国际上普遍使用种水源保护剂0.5%WaterShieldTM,加入水中,预防水源被支原体、真菌、霉菌污染。此试剂不易挥发。个月有效。

水槽只需定期添水即可。

优点:操作方便,价格便宜。

总之,细胞培养中,支原体污染发生频繁。有时带来的危害会造成实验的巨大损失。应经常检测和及时排除支原体污染,让细胞在健康安全的环境下生长,为获得准确的实验结果,打下良好的基础。

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